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ESTUDIO MORFOMETRICO DEL NUCLEO CELULAR EN EL CARCINOMA DE CELULAS RENALES

Autores: Belkis Ángela, Cabrera Roche 1, Yunexy, Aguado Besú 2, Iván, Triana de La Paz 3 , Raúl, López  Pérez 4 , María de los Ángeles , Madrigal Castro 5 , Danelis García Moya 6
1 Especialista 1er grado MGI e Histología, Departamento Ciencias Básicas Biomédicas, 
Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas, Provincia Villa Clara, País Cuba.
belkisacr@ infomed.sld.cu
2 Especialista 1er grado MGI , Residente de 3er año de Histología  , Departamento Ciencias Básicas Biomédicas,  Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas , Provincia Villa Clara , País Cuba .
3 Especialista 1er grado MGI e Histología, Departamento Ciencias Básicas Biomédicas, 
Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas, Provincia Villa Clara, País Cuba.
4 Especialista 1er grado MGI e Histología, Departamento Ciencias Básicas Biomédicas,  Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas, Provincia Villa Clara, País Cuba.
5 Especialista en Docencia y Psicopedagogía, Departamento Ciencias Básicas Biomédicas,  Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas, Provincia Villa Clara, País Cuba.
6 Especialista 1er grado MGI , Residente de 3er año de Anatomía  , Departamento Ciencias Básicas Biomédicas,  Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas , Provincia Villa Clara , País Cuba

Introducción
El riñón humano es un órgano complejo que tiene como función principal realizar la filtración de los productos residuales de la sangre y producir orina, con la finalidad de garantizar la excreción de sustancias finales del metabolismo como urea, ácido úrico y creatinina.1 
Las neoplasias malignas constituyen en la actualidad una de las primeras causas de muerte a nivel mundial y las que afectan este órgano, representan el 20 por ciento de todas las muertes provocadas por cáncer en el hombre y el cuatro por ciento en las mujeres.  La patología neoplásica renal es muy diversa. El adenocarcinoma renal, también conocido como carcinoma de células renales (CCR);  representa más del 90 por ciento de los tumores malignos que afectan a este órgano. 2,3        
La Organización Mundial de la Salud (OMS) en el año 2004, lo clasificó en cuatro categorías principales: carcinoma de células claras (80 por ciento), carcinoma  papilar, tipos 1 y 2 (10 por ciento), carcinoma  cromófobo (cinco por ciento), y de los conductos colectores (uno por ciento).2,4   
La bibliografía que se refiere a la clasificación descrita por Fuhrman la cual resulta ser la más utilizada por la mayoría de los patólogos desde su creación, a pesar del inconveniente de estar determinada por la subjetividad de los observadores.4-6    
Para minimizar estos errores subjetivos se desarrollan diferentes sistemas de magnificación de imágenes y de medición mediante microscopía óptica, con la idea de obtener una cuantificación objetiva de los diferentes parámetros. 7, 8     
Con el advenimiento de la computación ha surgido la posibilidad de digitalizar las imágenes, lo que se une en la actualidad a la existencia de programas de computación que con un mínimo de recursos son capaces de determinar los parámetros fundamentales utilizados en el diagnóstico anatomopatológico cuantitativo como complemento del diagnóstico cualitativo básico . 9
Este método se basa en el procesamiento digital de imágenes empleando medios informáticos. De esta manera los parámetros morfométricos constituyen una herramienta que permite una mejor comprensión de los procesos patológicos.10, 11  
La incidencia mundial anual de carcinoma de células renales se incrementa  cada año. 12   En Cuba, esta enfermedad se manifiesta de igual manera y se reporta una incidencia anual aproximada de 1210 casos.8  De manera particular durante los últimos años en la provincia de Villa Clara también se ha constatado un incremento de las cifras incidentales. (Anuario Estadístico. Departamento Anatomía Patológica del Hospital Arnaldo Milián Castro, Villa Clara).
Al tener en cuenta los datos estadísticos anteriormente y con el propósito de establecer parámetros cuantitativos que apoyen el diagnóstico cualitativo tradicional, es que nos motivamos  a realizar el presente estudio.

Objetivos
Específicos:

Describir las variables morfométricas del núcleo de los epiteliocitos de los túbulos renales en el carcinoma de células renales.

Determinar si existen diferencias en los distintos tipos histológicos del carcinoma de células renales en cada variable morfométrica.

Materiales y métodos
Se realizó un estudio descriptivo transversal, l de las características morfométricas del núcleo celular de los epiteliocitos de los túbulos renales en los diferentes tipos  de carcinoma de células renales de aquellos pacientes diagnosticados con esta enfermedad en el Hospital Universitario "Arnaldo Milián Castro” de la provincia de Villa Clara.

Población de estudio
La población de estudio quedó constituida por 30 pacientes que resultaron diagnosticados con carcinoma de células renales en el período de enero del 2012 a diciembre del 2013  a partir de los resultados de las biopsias realizadas. No fue necesario aplicar ninguna técnica de muestreo. 
Como criterio de inclusión se tuvo en cuenta la  adecuada calidad en la preparación de las  láminas histológicas de las biopsias.
La muestra del estudio estuvo conformada por las láminas histológicas de las biopsias, que cumplieron con la adecuada calidad, de 30 pacientes diagnosticadas con carcinoma de células renales en el período de enero del 2012 a diciembre del 2013.
Del archivo del departamento de Anatomía Patológica se tomaron las boletas de biopsias y los bloques de parafina que contenían las muestras de tejidos y fueron trasladados al Laboratorio de Histopatología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ciencias Médicas “Dr. Serafín Ruiz de Zárate Ruiz” donde se cortaron con un micrótomo vertical. Se obtuvieron cortes seriados de grosor uniforme (cinco micrómetros), apropiado para la realización de las observaciones morfométricas.  Se colocaron en portaobjetos y se colorearon con la técnica de hematoxilina/eosina.
La observación morfológica de las láminas histológicas se realizó utilizando el microscopio óptico binocular Optech con lente ocular de 10X y  objetivo de 40X. Las imágenes observadas fueron captadas con una cámara digital Canon Power Shot G11 acoplada al mismo; para efectuar las mediciones se utilizó el sistema morfométrico Image J®, programa de análisis y procesamiento de imágenes de dominio público, versión 1.44 (National Institutes of Health, USA). 13,14  
A cada una de las 30 láminas histológicas seleccionadas se le tomaron 10 microfotografías. Se midieron los núcleos de aquellas células en los que se observaron bien los nucléolos. Se estudiaron 10 núcleos por cada microfotografía. Cada núcleo proporcionó parámetros morfométricos como área nuclear, perímetro nuclear, circularidad del núcleo así como diámetros nucleares mayor y menor. Se realizaron 50 mensuraciones por microfotografía,  lo que permitió 500 mensuraciones por cada lámina histológica, para un total de 15000 mediciones  realizadas.
Las mediciones se realizaron sobre las fotografías al 100 % de su tamaño, para ello se utilizó una escala de 10 micrómetros (434 pixeles).Todas las microfotografías procesadas fueron guardadas con sus trazos para consultas posteriores.

A cada núcleo le fueron realizadas cinco mediciones:

Área nuclear:

Es la medida de la extensión de un plano comprendido  de un determinado perímetro. Se determinó con  el contorno   de los núcleos.

Perímetro   nuclear:

Es la longitud del contorno de una figura.

Circularidad del núcleo:

Tiene un valor de uno cuando es un círculo perfecto y cero si es una línea.
Describe el grado de circularidad de un objeto. Se determinó con  el contorno  de los núcleos. Los valores presentados que más se aproximan a uno indican mayor circularidad, los más alejados reflejan mayor grado de irregularidad en el contorno de los mismos.

Diámetro nuclear mayor:

Línea de máxima longitud que pasa por el centro y une dos puntos opuestos  en una superficie dada.

Diámetro nuclear menor:

 Línea de mínima longitud que pasa por el centro y une dos puntos opuestos  en una superficie dada.

Técnicas, métodos y procedimientos para el análisis de la información
Las mediciones se guardaron en una hoja de calculo Microsoft Excel que luego fue importada para su procesamiento estadístico el cual  se realizó con el apoyo del paquete de programas estadístico SPSS (System Package for the Social Sciencies) versión 21.0 para Windows.
La estadística descriptiva nos permitió realizar la descripción de las variables morfométricas estudiadas a través de la utilización de las medidas de tendencia central y de dispersión relativa: media aritmética  y desviación estándar.
Para determinar si existen diferencias en  los distintos tipos histológicos del carcinoma de células renales en cada  variable morfométrica   se aplicó la prueba no paramétrica H de Kruskall-Wallis,  y se prefijó  un nivel de significación de α de 0,05 donde:

Si p < α, existen diferencias significativas entre los valores promedios de la variable morfométrica estudiada en los distintos tipos histológicos del carcinoma de células renales

Si p ≥ α, no existen diferencias significativas entre los valores promedios de la variable morfométrica estudiada en los distintos tipos histológicos del carcinoma de células renales.

Resultados
La Tabla 1 muestra los estadísticos descriptivos de las variables  morfométricas de los diferentes tipos histológicos del carcinoma de células renales. En la misma  se observa  que en el carcinoma cromófobo el área nuclear presentó un valor promedio mayor que en  el resto de los tipos histológicos (59,90 ± 3,35 micrómetros cuadrados), sin embargo el valor de la desviación estándar de esta variable resultó menor en este tipo de neoplasia en comparación con los demás tipos histológicos de CCR. Por su parte, el carcinoma papilar presentó el menor valor promedio del área nuclear (36,45 micrómetros cuadrados), con una desviación estándar de.12, 60 micrómetros cuadrados. En este mismo orden de ideas se corroboró que el carcinoma de células claras fue el tipo histológico que mayor desviación estándar presentó (21,21 micrómetros cuadrados); hecho que pudiera estar en relación con un mayor número de pacientes portadores de este tipo de cáncer (n= 21) los cuales presentaron diferentes grados de diferenciación celular donde el tamaño del núcleo varía y se incrementa a medida que estos aumentan.
El perímetro nuclear  indicó que el mayor valor promedio se encontró en el carcinoma cromófobo (27,60 ± 1,44 micrómetros), mientras que en el carcinoma de células claras esta variable tuvo el menor valor de media aritmética (21,54 ± 5,93 micrómetros). En este sentido es importante destacar que la mayor desviación estándar de dicha variable correspondió al tipo histológico de células claras (± 5,93 micrómetros) lo que está en relación con el hecho de que esta variable depende de los resultados del área nuclear y coincidir además con el tipo histológico que mayor número de casos aportó al estudio.
El análisis de los valores medios de la circularidad del núcleo  indica que el carcinoma de células claras presentó un índice de 0,87, cifra superior a la encontrada en el carcinoma cromófobo (0,82), sin embargo no se observaron diferencias notables de la desviación estándar en ellos (0,04 para ambos casos).
Otras variables estudiadas fueron los diámetros  nucleares mayor y menor del núcleo celular. El carcinoma cromófobo arrojó los valores promedio mayores de estas variables, ambos presentaron cifras de desviación estándar menores que el resto de los tipos histológicos estudiados, 9,40 ± 0,38 micrómetros y 8,08 ± 0,30 micrómetros respectivamente; por su parte, el carcinoma papilar mostró valores inferiores de sus medias, sin embargo la desviación estándar de estas variables en este tumor resultó superior. (7,55 ± 1,45 micrómetros y 5,8 ± 1,02 micrómetros, respectivamente).
Las diferencias existentes en los  distintos tipos histológicos del carcinoma de células renales en cada variable morfométrica  se pueden constatar en los gráficos del uno al cinco.
El Gráfico 1, por su parte, muestra los valores promedio del área para cada tipo histológico, en el mismo se observa que existen diferencias significativas (p=0,019), entre los valores promedio del área de los diferentes tipos histológicos del carcinoma de células renales.
De la misma manera, el análisis del Gráfico 2, indica que existen diferencias  significativas entre los valores promedios del perímetro nuclear  para cada tipo histológico. (p=0,022).
La circularidad del núcleo y sus valores promedios se muestran en el Gráfico 3. El mismo denota que no existen diferencias significativas entre las medias de  esta variable en los diferentes tipos histológicos estudiados (p=0,059).
El valor promedio de los diámetros nucleares mayor y menor aparece representado en los Gráficos 4 y 5. En ambos casos existieron diferencias significativas (p=0,026 y p=0,012) de los valores promedios de estas dos variables  en los distintos tipos histológicos estudiados.

Discusión
La morfometría nuclear se ha incentivado en los últimos tiempos debido a la subjetividad del grado histológico provocada por la variabilidad entre observadores y la falta de uniformidad en la correlación entre los diferentes sistemas de gradación con la supervivencia en los diferentes tipos de carcinoma de células renales.
Los trabajos sobre la implementación de técnicas de morfometría aplicadas a las enfermedades neoplásicas se han basado en la medición de determinados parámetros específicos del núcleo celular tales como área nuclear, diámetro nuclear, perímetro y el grado de circularidad o pleomorfismo de este componente celular, entre otros. El estudio de dichos parámetros ha permitido obtener medidas cuantitativas que han sido analizadas como factores pronósticos. 5
En un estudio realizado por Sung Sun Kim se realizó la comparación de las características morfométricas del núcleo entre el carcinoma renal cromófobo y el oncocitoma renal. Los valores de estos parámetros estudiados en el oncocitoma reflejaron similitud con las cifras obtenidas a partir del estudio del carcinoma cromófobo; lo cual demuestra que estas variables morfométricas no son útiles para discriminar entre ellos; es decir, no aportan resultados significativos desde el punto de vista cuantitativo que avalen la utilidad de la morfometría con este fin. Ante tales conclusiones, este autor  sugiere la implementación auxiliar de otros métodos de estudio que sean más específicos a la hora de emitir con certeza un diagnóstico diferencial entre estos tumores. Entre estos métodos se destacan la inmunohistoquímica, y la microscopía electrónica.15
Sánchez Zalabardo l señala que el aumento del área nuclear se relaciona con una disminución de la supervivencia global y de la supervivencia libre de enfermedad.16
En el hospital regional Reina Sofía de Córdoba se realizó una revisión de 279 biopsias renales, de las cuales 74 correspondían a carcinomas renales y 63 de ellas a la variedad de células claras se confirmó que los núcleos celulares en el carcinoma renal grado II son de un tamaño inferior a los de las neoplasias clasificadas como grado III.17      
En este sentido, Monge realizó un estudio de algunas variables morfométricas del núcleo, con el objetivo de compararlas con el tiempo de supervivencia de los pacientes, este autor identificó que los pacientes con tumores cuyas  áreas nucleares tenían valores elevados  tenían un tiempo de supervivencia menor que aquellos que presentaban áreas menores .18
En Argentina  luego de realizar estudios morfométricos en el núcleo de las células renales, determinaron la existencia de diferencias entre el carcinoma cromófobo y el oncocitoma, este último de naturaleza benigna. Esta autora argentina logró discriminar con esta técnica la presencia de “núcleos arrugados” con dos nucléolos  en el carcinoma cromófobo, de la presencia de núcleos  redondos y monótonos, con  nucléolo pequeño y único  en el oncocitoma. 19     

En otro estudio en el departamento de patología de un hospital en la ciudad de Craiova, Romania, se describieron las características histológicas de los diferentes subtipos de esta neoplasia y al describir al carcinoma papilar expresaron que sus células poseen un pequeño tamaño, con núcleos de pocas dimensiones, de tamaño uniforme, redondeado y en ocasiones pleomórfico, característica esta que determina el grado del tumor. Al hacer referencia al carcinoma de células claras expresan que las células del tumor exhiben redondez con un núcleo de localización central y dimensiones no muy marcadas. En tanto al carcinoma cromófobo lo describen con núcleos típicamente uniformes, esféricos (o casi de este modo), de tamaño pequeño y carente de un nucléolo visible. En algunos casos los núcleos son más grandes y con prominente nucléolo, y estas diferencias del tamaño del núcleo son dependientes del grado de la tumoración. 20               

Conclusiones
El carcinoma cromófobo presentó mayores valores promedio de área, perímetro y diámetros nucleares mayor y menor que el resto de los tipos histológicos, sin embargo el carcinoma de células claras mostró el mayor índice de circularidad del núcleo.
Los diferentes tipos histológicos del carcinoma de células renales no mostraron diferencias en sus valores promedios de circularidad del núcleo; mientras que en el resto de las variables morfométricas se evidenciaron valores medios diferentes.

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