Morfovirtual 2018
ESTUDIOS ULTRAMICROSCÓPICOS DE ESPERMATOZOIDES EPIDIDIMALES FELINOS CONGELADOS-DESCONGELADOS CON DISTINTOS DILUYENTES
María Candela Bonaura1,2, María Carla García Mitacek1,2, Romina Nuñez Favre 1,2, Susana Jurado3.
1Cátedra y Servicio de Reproducción Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina (CP 1900), 2CONICET, CABA, Capital Federal, Argentina; 3Servicio Central de Microscopía Electrónica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata. bonaura874@hotmail.com
Introducción
La recuperación de espermatozoides epididimales (EE) y criopreservación espermática son herramientas de gran potencial para preservar material genético. Es así que la recuperación de EE ofrece un material sumamente valioso a la hora de conservar material genético de un individuo que ha sufrido muerte súbita o debe someterse a orquiectomía. Sin embargo, durante el proceso de congelación-descongelación se pierde aproximadamente el 50% de la población inicial de espermatozoides debido a los efectos del proceso sobre las membranas, citoesqueleto, aparato motor y núcleo del espermatozoide (Watson, 1995; Mazur y col., 1970; Parks y Lynch, 1992). La evaluación morfológica usando microscopía electrónica de transmisión o de barrido es muy ventajosa ya que provee información detallada sobre la morfología e integridad de la célula espermática que no es posible obtener por medio de otras metodologías. Si bien las pruebas rutinarias de contrastación seminal brindan información sobre la cantidad y calidad de los espermatozoides de una muestra, estas no ofrecen información completa sobre el potencial fertilizante del material seminal (Jurado y col., 2008; Dunphy y col., 1989). La motilidad y morfología espermática evaluadas mediante microscopía óptica, son indicadores aproximados de la capacidad fertilizante de ese semen; sin embargo, un daño a nivel subcelular puede afectar la fertilidad sin modificar la motilidad espermática o la morfología espermática observable al microscopio óptico (Blottner y col., 2001). De esta forma, células espermáticas morfológicamente normales al microscopio óptico pueden presentar alteraciones estructurales que solo serían detectables al microscopio electrónico (Tasseron y col., 1977). El estudio de la ultraestructura espermática nos brinda información detallada sobre la integridad del espermatozoide pudiendo ser una herramienta de gran utilidad en la detección de alteraciones estructurales que interfieren en el proceso de fecundación. Esta información posibilita precisar la fertilidad del semen evaluado con mayor exactitud que otras pruebas de análisis de semen in vitro (Jurado y col., 2008).
La microscopía electrónica ha sido utilizada en humanos para la detección de malformaciones espermáticas y permite evaluar alteraciones que causan infertilidad en los mismos (Baccetti y col., 1995; Baccetti y col., 2002). En animales, la microscopía electrónica ha sido utilizada como una herramienta para el estudio morfológico de la célula espermática (Holt y col., 1998; Alvarenga y col., 2000; Jones y Stewart, 1979). En caninos el uso del microscopio electrónico de barrido (MEB) y el microscopio electrónico de transmisión (MET) han permitido identificar anormalidades espermáticas en el semen fresco, así como algunos de los daños ocurridos durante el proceso de congelación-descongelación del semen criopreservado (Holt y col., 1998; Jurado y col., 2008). Para establecer el grado de daño asociado al proceso de congelación-descongelación de los espermatozoides, el examen morfológico estructural y ultraestructural es de vital importancia, y permite detectar defectos a nivel de cabeza, pieza media y cola (Hammerstedt y col., 1990; Parks y Graham, 1992; Jurado y col., 2008). El MET es la herramienta más eficaz al momento de detectar daños submicroscópicos y la localización de los mismos luego de realizar algún tratamiento (Jurado y col., 2008; Ozkavukcu y col., 2008; Plummer y Watson, 1988; Reichart y col., 2000). El estudio ultraestructural del semen congelado-descongelado permite observar no solo la ocurrencia del daño celular sino también la estructura afectada estimando de esa manera el impacto protector de los diluyentes (Jurado y col., 2008; Savignone y col., 2008).
En la especie felina existe una gran variabilidad individual en los parámetros seminales, particularidad que influye en la calidad y capacidad fecundante del semen. A pesar de los avances en la microscopía electrónica de transmisión, son escasos los trabajos que estudian el espermatozoide en esta especie (Long y col., 1996; Pukazhenthi y col., 1999; Tebet y col., 2006). Debido a que aún no se encuentran estandarizados los protocolos de congelación para la preservación de espermatozoides felinos (EF), la utilización de la microscopía electrónica podría brindar datos que permitan mejorar los protocolos de congelación con el consecuente aumento de la supervivencia espermática al descongelado. Por lo que el estudio ultramicroscópico adquiere significativo valor para evaluar el tipo y localización del daño para determinar el comportamiento de un DIL en los diferentes compartimentos celulares.
Objetivos
El objetivo del presente trabajo fue estudiar las alteraciones ultramicroscópicas observadas en los EF congelados-descongelados y caracterizar el tipo de daño según el diluyente utilizado. La hipótesis fue que los EF congelados-descongelados presentan alteraciones ultraestructurales relacionadas con la formulación del DIL utilizado.
Materiales y métodos
Con el fin de cumplir con el objetivo planteado se diseñaron cuatro experimentos.
Experimento 1
Se utilizaron felinos (n=15) mestizos, sanos, de entre 24 y 36 meses de edad, con un peso entre 3 y 5 Kg y en actividad sexual, aplicando un diseño aleatorio (Petersen, 1985). Los felinos utilizados fueron incluidos en un plan de control urbano de la reproducción. Luego de la orquiectomía bilateral, los testículos y epidídimos (EPI) de cada animal se colocaron inmediatamente en solución fisiológica con el agregado de 100 IU/ml de penicilina, mantenidos a temperatura ambiente y enviados rápidamente al laboratorio (Slatter, 1993). Los EPI fueron procesados dentro de las 4 h posteriores a la orquiectomía, tiempo que se tarda desde la orquiectomía hasta la llegada de los órganos al laboratorio. Se separaron las colas de los epidídimos y se atemperaron en un baño termostatizado a 37°C por 10 minutos en 0,75 ml de Tris base (Tris 3,025g, ácido cítrico 1,27 g, fructosa 1,25 g, agua destilada csp 100 ml). La recuperación de los EE se realizó por cutting de la cola del epidídimo (Tittarelli y col., 2006).
Pruebas de contrastación del material seminal in vitro:
Los EE obtenidos en Tris base fueron colocados en un baño termostatizado a 37ºC y sometidos a las siguientes pruebas de contrastación para comprobar que reúne condiciones mínimas para su procesamiento:
1) Concentración espermática (CE; 106/ml), se calculó realizando el conteo en cámara de Neubauer (Johnston y col., 2001); 2) Motilidad individual (MI), una muestra de 10 ml de los EE frescos se depositó en un portaobjetos limpio a 37°C, se le colocó un cubreobjetos y se observó por microscopía a 400 X. Se estimó, en varios campos, el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva (Johnston y col., 2001); 3) Vigor (VI, escala 1-5), se depositó 10 ml de la muestra de los EE frescos en un portaobjetos limpio a 37°C, se le colocó un cubreobjetos y se observó por microscopía a 400 X. Se estimó, en varios campos, el tipo de movimiento individual (Johnston y col., 2001; Axnér y col., 1998); 4) Morfología espermática (ME; % de espermatozoides normales), se observaron 100 espermatozoides por microscopía a 1000 X utilizando tinción 15 Biopur (Axnér y col., 1998); 5) Acrosomas intactos (AI, % de acrosomas intactos), una muestra de los EE se procesó para su estudio por microscopía de fluorescencia con el conjugado de Pisum sativum aglutinin-isotiocianato de fluoresceína (Mendoza y col., 1992). Se observaron 100 acrosomas a 1000 X; 6) Integridad de membrana (IM, % membranas intactas), una muestra de los EE se procesó para su estudio por microscopía de fluorescencia con el conjugado de diacetato de carboxifluoresceína (DIC) y Yoduro de propideo (YP; Harrison y Vikers, 1990). Se observaron 100 espermatozoides 1000 X.
Para realizar la congelación de los EE se utilizaron dos diluyentes (n=2) diferentes. Un DIL Tris y un DIL con agregado de 0,312% Trealosa (TREA). Los EE recuperados se mezclaron con un volumen calculado de cada uno de los diluyentes descriptos para obtener una concentración final de 50 x106 espermatozoides/ml. Luego de un tiempo de equilibración los EE diluidos fueron envasados en pajuelas de 0,25 ml y congelados en vapores de Nitrógeno líquido (Bonaura, 2016). La descongelación se realizó a 37°C durante 1 minuto (Bonaura, 2016).
Experimento 2
Se utilizaron felinos (n=16) para la obtención de los EE. Para realizar la congelación de los EE se utilizaron dos diluyentes (n=2) diferentes. Un DIL Tris y un DIL con agregado de 0,5% de DMF y 4,5% de glicerol. Los EE fueron sometidos a las mismas pruebas de contrastación y proceso descriptos para el experimento 1.
Experimento 3
Se utilizaron felinos (n=15) para la obtención de los EE. Para realizar la congelación de los EE se utilizaron dos diluyentes (n=2) diferentes. Un DIL Tris y un DIL con agregado de 0,25% de SDS. Los EE fueron sometidos a las mismas pruebas de contrastación y proceso descriptos para el experimento 1.
Experimento 4
Se utilizaron felinos (n=18) para la obtención de los EE. Para realizar la congelación de los EE se utilizaron dos diluyentes (n=2) diferentes. Un DIL Tris y un DIL con agregado de 0,312% de TREA y 0,25% de SDS. Los EE fueron sometidos a las mismas pruebas de contrastación y proceso descriptos para el experimento 1.
Estudio ultraestructural
Se realizó el estudio ultraestructural de los EE frescos y los EE congelados-descongelados en los distintos diluyentes utilizados en cada uno de los experimentos con el fin de estudiar los cambios que provocan los procesos de congelación-descongelación sobre la célula espermática en relación al DIL utilizado.
Las muestras se fijaron en glutaraldehído al 2 % en buffer de fosfato (pH 7,2-7,4). Se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos y el pellet obtenido permaneció en el fijador durante 2 h a 4 ºC. La fijación secundaria se realizó con tetróxido de osmio al 1 % durante 1 h a 4ºC y posteriormente, los espermatozoides se deshidrataron en una serie creciente de alcoholes y se incluyeron en resina Epoxi (Jurado y col., 2008). Los cortes ultrafinos (90 nm) se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Estas muestras se examinaron con un JEM 1200 EX II (JEOL Ltd., Tokio, Japón) y se fotografiaron con una cámara Erlangshen ES1000W, Modelo 785 (Gatan Inc., Pleasanton, California, USA) del Servicio Central de Microscopía Electrónica de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP. Se evaluaron un mínimo de 100 cabezas y 100 colas.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados mediante ANOVA con PROC GLM de SAS® (SAS, 2003).
Marco bioético del uso de animales
Este experimento se realizó respetando las recomendaciones internacionales especificadas en la guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio y utilizando las recomendaciones de la Academia de Ciencias de EEUU referidas al uso de felinos como animales de laboratorio (National Research Council, 2002). Estas recomendaciones fueron tenidas en cuenta en lo referente a la atención veterinaria, medio ambiente, alimentación, sanidad, identificación, sujeción, administración de drogas, toma de muestras de sangre y procedimientos experimentales (National Research Council, 2002). Además contó con la aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio de la FCV-UNLP (26-4-12).
Resultados y discusión
A nivel ultraestructural el 83,5±9,59% de las colas de los EE frescos y el 58,8±5,66% de las cabezas mostraron morfología normal (Figura 1).
En todos los experimentos, el porcentaje de EE sin daños ultramicroscópicos fue significativamente mayor tanto en las cabezas como en las colas de los EE frescos en comparación con los EE congelados-descongelados (Gráficos 1.1 y 1.2). Las alteraciones ultraestructurales observadas en las muestras de EE congelados-descongelados en los distintos DIL en cada uno de los experimentos fueron: membrana plasmática hinchada, membrana acrosomal hinchada, membranas plasmática y acrosomal hinchadas, formación de pliegues en la membrana plasmática y/o acrosomal, ruptura de la membrana plasmática y/o acrosomal, vesiculación en la membrana acrosomal externa y plasmática; y vacuolas mitocondriales (Figuras 2-4).
Experimento 1
Se observó una tendencia a proteger más las cabezas de los espermatozoides congelados con TREA vs el DIL TRIS (22,04±4,45 vs 18,33±3,69 % de cabezas normales, respectivamente).
Experimento 2
Se observó una tendencia a proteger más las colas de los espermatozoides congelados con el DIL TRIS vs el DIL con DMF (64,66±11,18 vs 52,8±5,39% de colas normales, respectivamente).
Experimento 3
Se observó una tendencia a proteger más las cabezas de los espermatozoides congelados con el DIL SDS vs el DIL TRIS (28,58±5,47 vs 21,42±5,76% de cabezas normales, respectivamente).
Experimento 4
Se observó una tendencia a proteger tanto las cabezas como las colas de los espermatozoides congelados con el DIL TREA-SDS vs el DIL TRIS (24,18±3,94 vs 17,33±1,65; 53,55±6,99 vs 42,95±1,28% de las cabezas y as colas normales, respectivamente).
Las alteraciones que se observaron con mayor frecuencia en la cabeza de los EE criopreservados fueron la membrana plasmática y acrosomal vesiculadas y la membrana plasmática rota. Mientras que en la cola los daños más frecuentemente observados fueron la membrana plasmática hinchada y la presencia de vacuolas en las mitocondrias.
El estudio ultramicroscópico nos permitió evaluar el grado de daño provocado por los procesos de congelación-descongelación sobre las células espermáticas felinas y sus estructuras, lo que concuerda con lo observado en otras especies como caninos, bovinos, ovinos, porcinos, chinchilla y humanos (Stornelli MA y col., 2004; Stornelli MA y col., 2007; Jones y Stewart, 1979; Quinn y col., 1969; Nath, 1972; Pedersen y Lebech, 1971; Healey, 1969). Además, nos permitió localizar los daños y demostrar que las principales alteraciones se observaron en la membrana plasmática, membrana acrosomal y en las mitocondrias, coincidiendo con los hallazgos de otros autores (Jurado y col., 2008; Rodriguez-Martinez y col., 1993; Ström y col., 1998; Silva y col., 2009). En concordancia con Ardtit y col., nuestras observaciones sugieren que la criopreservación induce también un daño en las mitocondrias, y que esto podría ser la causa de la disminución en la motilidad espermática al descongelado (Ardrit y col., 2006).
Nuestro estudio permitió también estimar la capacidad protectora de los DIL utilizados según la formulación de los mismos.
Conclusiones
Para mantener el potencial fértil de los espermatozoides luego del proceso de criopreservación, es necesario mantener la integridad estructural y funcional de las membranas. Por lo tanto, los daños hallados en nuestro estudio podrían señalar que los espermatozoides criopreservados en los distintos experimentos poseen comprometida su capacidad fecundante. Sin embargo son necesarias pruebas de fertilidad para poder confirmarlo.
El estudio ultramicroscópico de los EF nos permitió observar alteraciones ultraestructurales que no se pueden detectar por métodos de evaluación seminal de rutina. Podemos concluir, que el estudio ultramicroscópico reveló un mayor porcentaje de alteraciones en los EF congelados-descongelados en comparación con los espermatozoides frescos, hecho que muestra que el proceso de criopreservación afecta a la célula espermática como ha sido demostrado en otras especies. Se observó una tendencia a proteger más las cabezas de los espermatozoides congelados con DIL TREA y con DIL SDS al compararlo con el DIL TRIS, así como una tendencia a proteger tanto las cabezas como las colas con el DIL TREA+SDS comparado con el DIL TRIS. El estudio de mayor número de muestras permitiría definir si esta tendencia marca un efecto protector del disacárido y/o el detergente sobre las estructuras arriba mencionadas. Los resultados obtenidos aportan valiosos datos que permiten avanzar en el estudio del proceso de criopreservación en el felino doméstico.
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